CNE:CNE （保守非编码元件）是指在演化过程中，在不同物种的基因组之间序列高度相似，但却不编码蛋白质的DNA片段。CNE 广泛分布于基因组的非编码区。
目前先从李老师那边借到质粒，已经和惠华师姐了解到是带着别人做过cne序列的质粒，所以首先要将多余片段去除，即设计引物直接扩增线性化片段。（需要和李老师联系确定并获得质粒）
其次挑选3个罗非鱼和南极鱼的CNE序列（即需要构建6个质粒，即实验组和对照组：南极鱼和罗非鱼），设计引物将目的片段扩增出，师姐建议dna片段先扩出一个大片段，后扩出目标片段，提高片段的特异性。即**从DNA克隆目的片段，**因为加同源臂效率比较低，如果要直接从cDNA中p出目的基因的cds并且加上同源臂难度很大。先用一对5’UTR和3‘UTR的引物p出目的基因。切胶做胶回收（也可不做，如果条带特异，可以直接稀释pcr产物进行加同源臂的pcr）
在snapgene上构建好质粒质粒线性化引物，用这对引物打开环化质粒同源臂引物，在目的基因的cds前后加上和质粒尾部相同的同源臂（40bp左右，一半在质粒上，一半在基因上。）即质粒和目的基因各带20bp的尾巴。
加同源臂的PCR、质粒线性化PCR对上一轮的产物用同源臂引物PCR，在cds前后加上一段序列，用于同源重组。切胶回收加了同源臂的序列、线性化质粒（50u的体系跑胶回收，质量需要高） 这一步需要设计两对同源臂的引物
同源重组按照说明书计算好插入片段和线性化质粒的添加量。重组后导入感受态细胞中涂平板（一般是氨苄抗性），过夜。第二天早上挑单克隆，做菌p。菌p后，选择正确的送测。测序结果正确，15ml 液体LB扩培，提质粒。
需要用到的试剂以及说明书：爱博泰克的同源重组酶：2X MultiF Seamless Assembly Mix (RK21020)（目前zzc用过最好用的同源重组酶、便宜量大，0失败）
RK21020.pdf441.5 KiB感受态细胞DH2α
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