Cal-520AM工作液 1.在实验当天，用DMSO溶解Cal-520@AM或将等份的指示剂储备液解冻至室温。 2.在您选择的缓冲液(例如HBSS缓冲液)中，加入0.04%Pluronic@F-127，配制浓度为5M的Cal-520AM储藏液。对于大多数细胞系，推荐Cal-520AM的终浓度为5uM。细胞加载所需的指示剂确切浓度必须凭经验确定。
我们购买的是50微克一瓶的染料，因此在使用DMSO溶解Cal-520@AM染料时，需在每瓶中加入9.07微升的DMSO，充分涡旋混匀，制备5mM的储备液，实验时需根据孵化数量配置成5uM的工作液浓度。以10ml工作液为例：加入20微升的5M的Cal-520AM储藏液，再加入9980微升0.04%Pluronic@F-127的Hanks
含0.04%Pluronic@F-127的Hanks配置：Pluronic F-127配制成20%的DMSO溶液储存液。溶解过程需要在40-50ºC加热约30分钟，溶解后宜室温保存，不宜冷藏或冷冻。如果发现有结晶析出，可以在37-50ºC加热溶解。吸取9980的Hanks缓冲液，加入20微升的20%的储存液，即可配置成工作液。
| Pluronic F-127工作液配置 | 10ml |
|---|---|
| 20%的储存液 | 20 uL |
| HBSS（Hanks缓冲液） | 9980 uL |
| 工作液配置 | Cal-520AM 10ml |
|---|---|
| Cal-AM | 20uL |
| Pluronic F-127（工作液） | 9980uL |
酶解细胞、离心、去上清。
取1ml培养基重悬细胞，进行细胞计数。
对于需要转染进行后续实验的细胞,在24孔板中使用多聚赖氨酸爬片，接种不同数量的细胞：
第二天根据不同浓度的细胞视野下选择合适汇合度的细胞进行钙流实验，一般为细胞密度为50-60较好
TBN细胞：目前存在TBN细胞爬片爬不上的问题，已重新复苏细胞进行检测。
1.在生长培养基中制备细胞并培养过夜。 2.第二天，取出细胞培养皿，使用HBSS缓冲液进行冲洗，冲洗两次洗去死掉的细胞。 3.吸取适量的Cal-520AM工作液进行孵化，将加载了染料的细胞板在37C细胞培养箱中孵育1至2小时。 注意:在某些细胞系中，染料孵育超过2小时可提高信号强度。我们这里需要对孵化时间进行摸索，需确认不是因为孵化细胞时间过长导致细胞死亡，因此计划孵化1h观察细胞状态再选择是否继续孵化。 4.用HHBS或您选择的缓冲液(如果适用，可包含阴离子转运蛋白抑制剂，如1mM丙舒)替换染料工作液，以去除多余的探针。 5.采用灌流的方式，使用空白的HBSS平衡页面并进行对焦。按需添加刺激物，并同时使用配备FITC滤光片组的荧光显微镜，或使用含有可编程液体处理系统(如FLIPR、FLYPR或FlexStation)的荧光读板机，在Ex/Em=490/525nm(截止波长515nm)下测量荧光。
同时本次实验需观察染料淬灭的时间问题，从将加载了染料的细胞取出的时候算起，每隔半小时对细胞进行拍照，观察荧光的强度和淬灭时间。