孵化条件改变

Sensitivities of Two Zebrafish TRPA1 Paralogs to Chemical and Thermal Stimuli Analyzed in Heterologous Expression Systems

1. 细胞加载液（可直接采用）：
   • 预温的 HBSS（或您常用的细胞外液）
   • 1-5 µM fura-2 AM
   • 0.01% Pluronic acid
   • 2.5 mM Probenecid
2. 加载步骤：
   • 移除培养液，加入加载液。
   • 37°C 避光孵育 20-45分钟（具体时间需优化）。
   • 移除加载液。
3. 洗涤与去酯化（关键调整步骤）：
   • 用预温的、不含染料的 HBSS（含 2.5 mM Probenecid，可选加 20 mM HEPES）洗涤细胞2-3次。
   • 加入新鲜的上述缓冲液，在室温或37°C避光静置 **15-30分钟**，完成去酯化。
4. **成像缓冲液**：
   • 使用不含淬灭剂的 HBSS-HEPES 缓冲液进行成像。

DMEM培养基和HBSS——孵化环节对比

使用DMEM basic作为孵育液。

高钙、高糖、强CO₂依赖的缓冲系统 会严重干扰钙信号的基线、反应幅度和动力学，并可能导致细胞在实验过程中因pH失衡而状态变差。

HBSS是钙成像、药物刺激等短时（几小时内）功能学实验的“黄金标准”孵育液。

它提供了稳定、生理、无营养干扰的环境，让您观察到的信号变化主要源于您的实验干预（如药物），而非培养基成分的干扰。

两者在实验流程中的正确角色：